PI、7-AAD和DAPI的區別

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PI 7-AAD DAPI
英文全稱 Propidium iodide
碘化丙啶		 7-amino-actinomycin
D7 氨基放線菌素		 4',6-diamidino-2-phenylindole
4, 6-聯脒-2-苯基吲哚
染色原理 熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，常用于細胞凋亡檢測，英文全稱是Propidium Iodide。它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。 7-AAD是一種核酸染料，它不能通過正常質膜，隨著細胞凋亡、細胞死亡過程，質膜對7-AAD的通透性逐漸增加，結合細胞凋亡中DNA的有控降解，在合適波長激發光的激發下可發出明亮的紅色熒光，通過7-AAD標記DNA的強弱，將細胞分為三群：7-AAD強為死亡細胞，7-AAD弱是凋亡細胞，7-AAD-為正?；盍毎?。 DAPI可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發揮標記的作用，可以產生比DAPI自身強20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。
膜通透性 否 否 能
染色位置 細胞核 細胞核 細胞核
靈敏度 中 中 高
檢測通道 使用488nm激發，用610/20BP收集，FL-2檢測通道 用488nm激發，用670/14BP收集，FL-3檢測通道 用355nm激發，用440/40BP收集；
可用405nm激發，450/50BP收集
能否檢測
早期細胞凋亡		 能 能 不能
缺點 不能區別晚期凋亡和壞死細胞 不能區別晚期凋亡和壞死細胞 強烈致癌
使用方法
  1. 用合適的方法誘導細胞凋亡；
  2. 懸浮細胞離心（1500rpm 離心 5min）收集；貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化并用含血清培養基洗一次（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；或直接用Accutase酶消化（無需終止）；1500rpm離心5min收集細胞；
  3. 用PBS洗滌細胞兩次（1500rpm離心5min）收集1-5 X 105細胞，棄上清；
  4. 制備1 X Binding Buffer緩沖液：按10次分析的量計算，加1mL 5 X Binding Buffer緩沖液到 4mL 的去離子水；
  5. 500uL 1 X Binding Buffer重懸細胞(第4步稀釋的緩沖液）
  6. 加入5uL annexin-V FITC和10μL PI
  7. 避光室溫孵育5分鐘
  8. 上機檢測
  1. 通過合適的方法來誘導細胞凋亡；
  2. 清洗兩次細胞；在第二次清洗后，去除細胞顆粒殘留的PBS。
  3. 在冷的1X結合緩沖液重懸細胞，使細胞濃度達到1x106到1x107cells/mL。
  4. 添加100μL細胞（106個）懸液到每管。
  5. 添加5μL Annexin V-PE 和 10μL的7-AAD。
  6. 溫柔混勻，冰上孵育15分鐘。
  7. 不用清洗，添加1X結合緩沖液到每管。
  8. 流式數據分析。
  1. 稀釋DAPI儲存液到3 微摩染液（100mM Tris, PH7.4, 150Mm, NaCl, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2, 0.1% Nonidet P-40），每個細胞樣品中需要1 ML。
  2. 在室溫下，輕輕彈管使得細胞顆粒分散，添加5mL的PBS，讓細胞水化15分鐘。
  3. 離心上述的懸浮細胞，棄懸浮液。輕輕彈管使細胞分散，添加1ML的被染液稀釋的DAPI容液。
  4. 流式分析染料的存在。如果細胞在綠色熒光顯微鏡下能夠看到，離心樣本，去除上清，在新鮮的緩沖溶液中重懸。
  5. 提供一滴到顯微載玻片上，用蓋玻片蓋住，觀察。