文章目錄[隱藏]
流式檢測Th1、Th2以及Th17細胞是免疫學研究中的一項重要技術，主要用于檢測和分析這些不同亞型的輔助性T淋巴細胞（Th細胞）在免疫應答中的作用和平衡狀態。
小科今天給大家帶來Th1/Th2/Th17細胞的簡要介紹，并講解其檢測指標以及實驗所需的一些注意事項。
一、Th1/Th2/Th17細胞介紹
1.Th1細胞：Th1細胞主要介導細胞免疫應答，促進炎癥反應和清除胞內病原。它們分泌的細胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF-α等，在免疫應答中發揮關鍵作用。
2.Th2細胞：Th2細胞主要參與體液免疫應答，促進過敏反應和寄生蟲感染的清除。它們分泌的細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等，在體液免疫和過敏反應中發揮重要作用。
3.Th17細胞：Th17細胞是近年來發現的一種新的Th細胞亞群，主要分泌IL-17等細胞因子，參與炎癥反應和組織損傷。它們在自身免疫性疾病、感染性疾病以及腫瘤等疾病的發生和發展中扮演重要角色。
二、Th1/Th2/Th17細胞檢測指標選擇
小科查閱相關Th高分文獻，幫大家總結了Th1/Th2/Th17細胞常見流式檢測指標
人以及大鼠樣本Th1/Th2/Th17細胞檢測指標
（備注：Th 細胞的表面標志為 CD3+CD4+，而當用 PMA /Ionomycin刺激人和大鼠抗凝血 4 小時，會發現 CD4+的細胞明顯減少，甚至消失，這是因為 PMA/Ionomycin 會誘發細胞表面 CD4 分子被內吞。所以通常的做法是用 CD3 和 CD8 反設 CD4 細胞，即 CD3+CD8-的細胞被認為是 CD3+CD4+的細胞。）
小鼠樣本Th1/Th2/Th17細胞檢測指標
聯科生物Th試劑盒
聯科Th試劑盒部分引用文獻
1、Wang, Hongxing et al. T-Cell Immune Imbalance in Rheumatoid Arthritis Is Associated with Alterations in NK Cells and NK-Like T Cells Expressing CD38. Journal of innate immunity vol. 14,2 (2022): 148-166.
2、Ding Y, Wang Y, Zhang Y, et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine. 2023;116:154825.
3、Yu Q, Yu F, Li Q, et al. Anthocyanin-Rich Butterfly Pea Flower Extract Ameliorating Low-Grade Inflammation in a High-Fat-Diet and Lipopolysaccharide-Induced Mouse Model. J Agric Food Chem. 2023;71(31):11941-11956.
4、Li Q, Liu W, Zhang H, et al. α-D-1,3-glucan from Radix Puerariae thomsonii improves NAFLD by regulating the intestinal flora and metabolites. Carbohydr Polym. 2023;299:120197.
三、流式檢測Th1/Th2/Th17細胞實驗步驟
進行流式檢測Th1/Th2/Th17細胞常規的實驗步驟由以下六個部分組成
下面是采用聯科生物的試劑盒檢測人外周血Th1/Th2/Th17細胞具體步驟：
示例：人的外周血Th1/Th2/Th17細胞檢測
試劑盒采用了聯科生物人Th1/Th2/Th17染色試劑盒
產品名稱：Human Th1/Th2/Th17 Staining Kit
樣本：人的外周血
實驗步驟
1、采用肝素抗凝管取血，取125 u L抗凝血至流式管中，加入125 u L不含血清的培養基和1 u L PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 u L BFA/Monensin Mixture (250×)。取125 u L抗凝血和125 u L不含血清的培養基，作為對照?；靹?，37℃孵育4 - 6 小時，每隔1 - 2 小時取出震蕩混勻。
2、從樣本管和對照管中取100 u L 細胞懸液至新的流式管中，加入5 u L Anti-Human CD3, APC-Cy7和5 u L Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5。震蕩混勻，室溫避光孵育15分鐘。
3、每管加入100 u L FIX & PERM Medium A，震蕩混勻，室溫避光孵育15分鐘。
4、每管加入1 ml預冷1× Flow Cytometry Staining Buffer，300 × g離心5分鐘，棄上清。
注：液體盡量倒干凈，不要有殘留。
5、每管加入 100 u L FIX & PERM Medium B、5 u L Anti-Human IFN-γ, FITC、5 u L Anti-Human IL-4, APC 和 5 u L Anti-Human IL-17A, PE。震蕩混勻，室溫避光孵育 15 分鐘。
6、每管加入 1 m L 1× Flow Cytometry Staining Buffer，300 × g 離心 5 分鐘，棄上清。
7、每管加入 500 u L 1× Flow Cytometry Staining Buffer 重懸，上機檢測；或者加入 500 u L 1 - 4 %多聚甲醛重懸，2 - 8℃避光，于 24 小時內檢測。
實驗結果示意圖;
如上圖所示，首先根據FSC/SSC確定淋巴細胞進行圈門，利用CD3+圈出T淋巴細胞群；再分別根據IFN-γ+和CD8-表示Th1細胞群、IL-4+和CD8-表示Th2細胞群以及IL-17A+和CD8-表示Th17細胞群，進行圈門。
四、流式檢測Th1/Th2/Th17細胞實驗注意事項
1.當使用血液樣本不需要提取PBMC時，需要采用肝素抗凝管收集樣本；
2.當使用血液樣本需要提取PBMC時，收集樣本可以選擇EDTA管也可以選擇肝素抗凝管；
3.做Th實驗時，需要做一個生物陰性對照（或者同型對照），因為我們能檢測到的細胞因子數量少，不利于我們后續進行數據分析圈門；
4.刺激劑如PMA（佛波酯）和Ionomycin（離子霉素）常聯合使用，會導致人T細胞表面CD4發生內吞，所以我們通常的做法是用 CD3 和 CD8 來反設 CD4 細胞，即 CD3+CD8-的細胞被認為是 CD3+CD4+的細胞；
5. 進行流式儀上機操作時，收取 20000 - 30000個 CD3+CD8-（CD4+） T 細胞，對于某一細胞因子，因人而異，分泌該細胞因子的細胞比例差異很大。為了進行統計學差異比較，需要獲取足夠多的細胞樣本。
