流式三要素之一|樣本篇

做流式實驗需要儀器、樣本以及試劑,對于流式實驗而言,樣本質量的高低對最終的檢測結果有很大的影響。進行流式實驗的樣本多為外周血、骨髓、各類體液(如腦脊液、胸水、腹水)以及人體的組織(如淋巴結、脾、肝等)。不同的樣本處理方法不同,想要獲得好的檢測結果,樣本的制備和保存很關鍵。

本文就為大家分享各種樣本的詳細處理方法。


1.外周血/骨髓

樣本保存:

收集樣本后置于加有抗凝劑(一般選擇肝素或EDTA)的試管中,室溫保存,盡量在12 h內處理樣本;若無法及時處理,4℃保存,此時最好選擇肝素抗凝管。

樣本制備:

一般不需要特殊處理制備單細胞懸液,所用試劑為淋巴細胞分離液和紅細胞裂解液。但在臨床檢測中,為了避免細胞成分丟失,通常不推薦使用淋巴細胞分離液分離單核細胞。

抗凝劑的選擇

血液標本可以使用EDTA、ACD(枸櫞酸葡萄糖)或肝素抗凝。ACD和肝素抗凝的樣本72 h內細胞是穩定的;EDTA抗凝48 h內是穩定的。

EDTA適用于白細胞的免疫表型分析,可防止成熟的髓系細胞貼壁造成細胞損失,并具有較強的抗血小板凝集能力,但對細胞活性的保持不如肝素抗凝。同時EDTA是二價陽離子的強螯合劑,會影響與Ca2+相關的抗原位點(如CD11b等),并會抑制與Ca2+相關的細胞功能。肝素常用于白細胞功能研究,可維持Ca2+和Mg2+在細胞內的生理濃度,更好保持細胞活性,適用于放置時間較長、不能及時檢測的樣本,但不適合血小板的相關檢測。

骨髓樣本優先選擇肝素抗凝。


2.體液(如腦脊液、胸水、腹水)

樣本保存:

收集樣本后置于肝素抗凝管中,室溫保存,且盡量在12 h內處理樣本。若無法及時處理,則4℃保存,時間最好不超過48 h。

樣本制備:

樣本1000-1500 rpm離心5 min,棄去上清;

加入含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PBS),離心洗滌5 min;

加入適量PBS重懸。如有細小沉淀,用300目尼龍網過濾后備用。


3.組織(如淋巴結、脾、肝等)

樣本保存:

切取新鮮組織樣本置于生理鹽水或PBS中,室溫保存,盡量在12 h內處理樣本;若無法及時處理,4℃保存,保存時間最好不要超過48 h。不建議用甲醛、乙醇固定細胞,不要用酶、表面活性劑處理細胞。

樣本制備:

常用的組織樣本制備單細胞懸液方法有:機械法、酶處理法、化學試劑處理法及表面活性劑處理法,在流式分析中,為保持抗原活性,多采用機械法處理樣本。采用機械法需注意動作輕柔,盡量減少細胞的損傷。

若實驗室無單細胞制備儀,手工剪切制備單細胞懸液:

PBS清洗組織樣本,去除大量紅細胞;

用眼科剪將組織剪成極小塊,再次PBS清洗;

組織小塊加入勻漿器中,加少量PBS勻漿;

用細注射針頭抽取細胞懸液;

300目尼龍網過濾;

加入含0.1%牛血清白蛋白的PBS;

1000-1500 rpm離心5 min,棄去上清;

加入適量PBS重懸。